永宁元年（301年），赵王司马伦篡位称帝。当时，王敦的叔父王彦正任兖州刺史。司马伦遂命王敦到兖州慰劳王彦，加以笼络。不久，齐王司马冏传檄天下，起兵讨伐司马伦。王彦虽收到檄命，但因畏惧司马伦兵力强盛，不敢应命，后因王敦力劝方才举兵。是年四月，司马伦兵败被杀，晋惠帝复位。王敦因功升任散骑常侍、左卫将军、大鸿胪、侍中。
永嘉元年（307年），王敦在族兄王衍的安排下，外任广武将军、青州刺史，后又被征拜为中书监。当时天下大乱，王敦将襄城公主的陪嫁侍婢百余人全部许配给军中将士，散尽府中库财，独自返回洛阳。
永嘉三年（309年），东海王司马越自荥阳入朝，不顾幕僚潘滔的反对，任命王敦为扬州刺史。[9]当时，琅琊王司马睿正以安东将军之职镇守建业（扬州州治，今江苏省南京市）。而王敦的从弟王导则在司马睿幕府担任安东司马，深受司马睿信任。王敦遂与王导一同帮助司马睿在江东树立威望，使得司马睿逐渐获取江东士族的拥戴。
永嘉四年（310年），王敦被征拜为尚书，与建武将军钱璯一同北返洛阳。但钱璯行至广陵（治今江苏省扬州市），却举兵叛乱，转而攻打王敦。王敦逃回建业，向司马睿告变。司马睿授王敦为安东军谘祭酒。王敦遂留在扬州，未再回朝。
早年任给事黄门侍郎，王衍荐为青州刺史，东海王司马越掌权时,任为扬州刺史。司马睿移镇建业,召为军咨祭酒，后又继刘陶任扬州刺史、都督征讨诸军事。与王导共同扶植司马氏的江东政权，消灭不从命的江州刺史华轶，以杜□为首的荆湘流民起义。东晋的经济、军事重心在于荆、扬二州，王敦进位镇东大将军、开府仪同三司,加都督江、扬、荆、湘、交、广六州诸军事、江州刺史，封汉安侯，掌握长江中上游的军队，统辖州郡，贡赋入己，将相官吏多出其门,专擅朝政,威胁晋室。晋元帝司马睿既畏惧又嫌恶，重用刘隗、刁协等与之抗衡，并放免扬州地区的僮客组成军队，任命刘隗为镇北将军，戴渊为征西将军，名义上北讨石勒，实则防御王敦。