太宁元年（323年）四月，王敦由武昌移镇姑孰（在今安徽省当涂县），屯驻于城东的于湖，并自领扬州牧，直接控制了京畿地区。此后，王敦权势更盛，甚至达到“四方贡献多入己府，将相岳牧悉出其门”的地步。他控制扬州江州、荆州、徐州等重镇，以沈充、钱凤为谋主，以诸葛瑶、邓岳、周抚、李恒、谢雍为爪牙，更纵容沈充等人胡作非为，有篡夺晋室之意。但在当时，王氏兄弟如王导、王彬、王舒、王棱等，都或明或暗地反对王敦。[71-74]王棱甚至因此被王敦暗杀。
司马绍面对“王敦，内外危逼”的局面，命郗鉴以兖州刺史之职镇守合肥，欲以其为外援对抗王敦。但王敦却表举郗鉴为尚书令，迫使司马绍将郗鉴召回朝中。郗鉴在入朝途中被王敦扣留于姑孰，但因素有名望，使得王敦未敢轻易加害。他最终还是被放回了建康，遂与司马绍共谋讨伐王敦。当时，王敦与钱凤等亲信密谋篡晋，不慎被堂侄王允之（王舒之子）获悉。王允之假装酒醉沉睡，骗过了王敦。他不久便以回京探父为由回到建康，通过王舒、王导将王敦的图谋报告给了司马绍。
王敦于不久后患病，因会稽内史周札一族（义兴周氏）势力强盛，便采纳钱凤的建议，决定铲除周氏，为后嗣子孙消除祸患。他指使庐江太守李恒，诬称周氏勾结妖道李弘图谋不轨。当时，周札的侄子周筵正在王敦的军府担任谘议参军。王敦遂在军中将周筵收捕处死，同时命沈充前往义兴（治今浙江宜兴）尽杀周氏子弟，随后又进兵突袭会稽（治今浙江省绍兴市），攻杀周札。后来，王敦又杀害司马绍的心腹冉曾、公乘雄等人，并以“三番休二”的方式减少宿卫的当值兵力。
王敦病势愈来愈重，遂矫诏拜养子王应（王含之子）为武卫将军，作为自己的继承人。他认为王应年少难当大事，在与钱凤等谋划后事时提出了三套方案：上策为放弃兵权，复归朝廷；中策为退回武昌，拥兵自守；下策为举兵东下，颠覆朝廷。钱凤却认为下策才是最好的计谋，遂与沈充决定在王敦死后发动叛乱。而与此同时，司马绍一面命侍中陈晷、散骑常侍虞騑去探问王敦病况，一面却微服到芜湖察看王敦大军的营垒预作讨伐的准备，还不断派遣大臣去询问王敦的起居。